色谱法详解

  ：气相色谱（GC）可拿来分离挥发性有机物。气相色谱仪由一个流动的流动相（通常是氦气或氢气）、一个进样口、一个包含固定相的分离柱和一个检测器组成。感兴趣的分析物在流动相（惰性气体）和固定相之间进行分配。在毛细管气相色谱中，固定相涂在通常由熔融石英组成的开放管柱的内壁上。可用的固定相包括不同取代基的甲基聚硅氧烷、不同修饰的聚乙二醇、用于分离的手性柱以及其他专门的固定相。固定相的极性可以变化以影响分离效果。

  气相色谱检测器包括火焰离子化检测器（FID）、热导检测器（TCD或热丝检测器）、电子捕获检测器（ECD）、光电离检测器（PID）、火焰光度检测器（FPD）、原子发射检测器（AED）和质谱仪（MS）。除AED和MS外，这些检测器会产生一个随从色谱柱出来的分析物量变化的电信号。除产生电信号外，AED还会生成分析物中选定元素的发射光谱。与其他GC检测器不同，MS对质量作出响应，这是一种所有有机物共有的物理性质。

  适用范围：毛细管色谱已用于分离复杂混合物、化学和物理上紧密关联的成分以及包含各种化合物的混合物。由于分离是基于流动相和固定相之间的分配，因此感兴趣的分析物必须在GC进样口温度（通常为50℃到300℃）下能挥发并且在气相中稳定。

  样品能够正常的使用分流、无分流或柱头进样器引入。在分流进样过程中，部分载气通过位于进样口底部的分流口不断排放，这样注入的样品同样比例会在注射时通过分流口排出。对于灵敏度或进样口降解不是问题的应用，进行分流进样。在无分流进样过程中，注射后的特定时间内分流口关闭，然后打开。对于灵敏度是问题但进样口降解不是问题的应用，且样品中有大量共提取物时，使用无分流进样。分流和无分流进样都使用进样口衬管。对于柱头进样，柱子直接对接到进样口，注射针立即进入柱头。在这种情况下，所有样品都沉积在柱头上，通常在低于所用溶剂沸点的注射温度下。对于灵敏度和进样口降解都是问题且样品提取物有限的应用，使用柱头进样。

  样品性质：样品以气体或液体溶液形式引入气相色谱。如果要分析的样品是固体，必须先将其溶解在合适的溶剂中，或者将基质中的分析物提取到合适的溶剂中。在复杂基质的情况下，能够正常的使用各种步骤将分析物从一些共提取物中分离出来，包括但不限于尺寸排阻色谱、液相色谱和固相萃取。

  定性分析：气相色谱同时提供几种类型的定性信息。色谱图的外观是样品复杂性的一个指标。分析物的保留时间大致根据挥发性进行分类。尽管保留时间还取决于化合物极性、固定相极性、柱温和流动相流速。GC-AED和GC/MS提供附加的定性信息。

  可溯源定量分析：无论使用何种检测器，GC仪器一定要使用已知浓度的分析物溶液和已知浓度的内标（替代物）进行校准。内标应与感兴趣的分析物化学性质相似，许多GC/MS应用使用同位素标记的分析物类似物。内标应添加到所有校准溶液和分析样品中，量应相同。校准可通过构建涵盖样品测量范围的校准曲线进行，或经过测量与分析物浓度相近的校准溶液计算响应因子。更多定量分析细节可参考本章的液相色谱部分。

  技术原理：液相色谱（LC）是一种用于分离和检测溶液中有机和无机化合物的方法。该技术广泛适用于极性、非极性、芳香族、脂肪族和离子化合物，基本上没有限制。仪器通常由溶剂输送装置（泵）、样品引入装置（进样器或自动进样器）、色谱柱和检测器组成。由于色谱柱适合特定分离问题，检测器具有敏感和选择性的响应，因此该技术具有很大的灵活性。任何液相色谱方法的目标都是将感兴趣的化合物从干扰物中分离出来，以便在色谱和/或检测域中实现与分析物水平成比例的仪器响应。

  技术原理：液相色谱中的保留是溶质分子在不同相中不同关联的结果。最简单的色谱系统包括两相：固定的“固定相”和流动的“流动相”。溶质分子在这些相之间的扩散通常发生在比流动相流动时间尺度更快的时间尺度上。溶质分子与固定相的差异性关联使这些物质在不同程度上被延迟，以此来实现分离。保留过程取决于溶质分子、固定相配体和流动相分子之间复杂的相互作用；

  色谱柱的特性（如基材的物理和化学性质、用于制备固定相的表面修饰程序、极性等）也对保留行为产生重大影响。可区分两种操作模式：反相液相色谱（RPLC）和正相LC。对于正相LC，流动相的极性小于固定相；反相LC则相反。开发LC方法时，色谱柱选择至关重要。大多数分离在反相模式下使用C18（十八烷基硅烷，ODS）柱进行。通常，色谱检测结果与分析物水平成比例，尽管还存在别的形式的检测。常见的检测器包括紫外/可见吸收（UV/vis）、荧光（FL）、电化学（EC）、折光指数（RI）、蒸发光散射（ELSD）和质谱（MS）检测。

  适用范围：液相色谱适用于可以在合适溶剂中溶解（或通过衍生化使其溶解）并可以从色谱柱中洗脱的化合物。准确的定量分析需要将感兴趣的成分与干扰物分离开来。液相色谱通常被认为是一种低分辨率技术，因为在单次分析中只能分离大约50到100种化合物；然而，可以实施选择性检测以提高系统的整体分辨率。最近的重点是使用质谱进行选择性LC检测。一般来说，液相色谱技术最适用于热不稳定或非挥发性溶质，这些溶质不适合气相分离技术（如气相色谱）。

  样品性质：液相色谱适用于各种样品类型，但在所有情况下，样品必须提取或溶解在溶液中，以便引入液相色谱。为减少样品复杂性，有时通过液液提取、固相提取或LC分级进行样品富集（净化）。样品提取物应与流动相混溶，通常使用小的进样体积（1 μL至20 μL）。当样品提取物与流动相成分不兼容时，能够直接进行溶剂交换。

  定性分析：液相色谱有时用于通过与标准物质的保留时间相对来说比较来进行样品组成的初步鉴定。鉴定一定要通过互补技术

  可溯源定量分析：液相色谱是一种需要校准的相对技术。校准和定量过程类似于其他有机分析仪器技术（如气相色谱、质谱、毛细管电泳和相关联用技术）。有机物的定量通常基于未知物和校准物的仪器响应比较。校准物的制备（通常基于质量分数）使用已知（高）纯度的参考标准。利用多种数学模型作比较。通常假定响应和分析物水平之间的线性关系；然而，这并非是定量的要求，也能够正常的使用非线性模型。

  可能适用的几种定量方法：外标法、内标法和标准加入法。外标法基于校准物和未知物中分析物的绝对响应比较。内标法基于分析物对添加到每个样品和校准物中的一个或多个化合物（内标）的相对响应比较。标准加入法基于向样品中添加一个或多个已知量的校准物，可能还利用内标。外标法通常用于没有内标或不可以使用内标，或者标准样品和未知样品的质量可以容易地控制或计算的情况。外标法需要谨慎，因为样品处理或引入过程中的损失将直接影响最终结果。所有体积（或质量）必须准确已知，并且样品转移必须定量。内标法利用一个或多个成分（内标，不存在于未知样品中），这些成分添加到校准物和未知物中。

  计算基于分析物对这些内标的相对响应。使用内标减少了对定量转移的需求，并减少了样品处理损失带来的偏差。内标应（理想情况下）具有与感兴趣分析物相似的性质；然而，即使与分析物性质无关的内标也可能作为“体积校正器”提供好处。分析物的同位素形式用于同位素稀释法。对于质谱法，常常要至少2的质量差异和在非活性原子上的替代。对于非质量选择性检测，分离同位素标记物种（如紫外吸收检测）有时是可能的。对于选择性检测（如质谱）技术，不需要分离内标，通常希望内标和分析物共洗脱以提高精度（如同位素稀释法）。标准加入法基于向未知物中添加已知量的校准物（有或没有内标）。每个未知物必须制备至少两个样品水平；一个样品可以是不加标的未知物。由于对每个未知样品进行单独校准，这种方法劳动强度大。

  毛细管电泳（CE）是一组基于带电物质在电场中移动的技术。图4.6显示了CE仪器的简化示意图。当系统施加电压时，带正电的物质向负电极（阴极）移动，而带负电的物质向正电极（阳极）移动。中性物质不受任一电极的吸引。分离通常在内径为25 μm到100 μm，长度为25 cm到100 cm的熔融石英毛细管中进行。毛细管充满缓冲液，施加电压通常在10 kV到30 kV之间。可用的检测策略包括紫外吸收、激光诱导荧光和质谱。

  CE适用于广泛的药物分析、生物分析、环境分析和法医学分析。根据分析物的类型和分离机制，采用不一样模式的CE。毛细管区带电泳（CZE）是最广泛使用的CE模式，通过一系列分析物在特定pH值下的大小和电荷差异实现分离。CZE的一些应用包括药物及其代谢物的分析、肽图谱绘制和营养补充剂中维生素的测定。中性化合物通常通过一种称为胶束电动毛细管色谱（MECC或MEKC）的技术使用胶束进行分离。CZE和MEKC都已用于对映体选择性分离。毛细管凝胶电泳（CGE）大范围的使用在蛋白质和核酸的分离。凝胶网络充当筛网，根据大小分离成分。毛细管等电聚焦（CIEF）根据分析物的等电点进行分离，并包含pH梯度。该技术常用于蛋白质的分离。毛细管等速电泳（CITP）利用两种缓冲系统的组合，有时用作其他CE技术的预浓缩方法。

  CE被视为液相色谱（LC）的替代方法，尽管CE尚未像LC那样成熟。CE通常比LC提供更高的效率，并且样品消耗更少。此外，CE的各种模式在方法开发中提供了灵活性。由于CE利用与LC不同的分离机制，它可被视为提供LC分析互补信息的正交技术。目前，CE的主要限制在于灵敏程度和重现性问题，但这些领域的改进仍在继续。

  CE的样品涵盖广泛的范围，包括生物流体、蛋白质消化产物和药物化合物等基质。根据样品基质，样品可以直接注射或用水或运行缓冲液稀释。可通过某些样品制备技术来优化灵敏度。分析物的衍生化常常要激光诱导荧光检测。

  CE非常适合于肽和蛋白质的定性分析。CE的高效率能够分离即使是紧密相关的物质，通过比较两个不同样品的“指纹”可以揭示细微的差异。

  CE中的定量通常通过制备已知浓度的分析物校准溶液，并比较已知和未知溶液的峰面积进行。CE中使用的定量方法通常类似于LC中使用的方法。CE的一个独特方面是峰面积与溶质迁移速度相关。通过将峰面积除以分析物的迁移时间获得的校正峰面积，能大大的提升CE的定量精度。

  液相色谱/质谱联用（LC/MS）和液相色谱/串联质谱联用（LC/MS/MS）

  液相色谱的原理在液相色谱部分中已覆盖。对于LC/MS，从LC柱流出的洗脱液进入质谱的源。对于电喷雾电离（ESI），洗脱液从一个高电荷孔口喷出，形成带电簇，这些簇在从孔口移动时失去溶剂分子，最终形成带电的分析物分子。对于大气压化学电离（APCI），使用电晕放电电离溶剂分子，溶剂分子作为化学电离试剂将电荷传递给分析物分子。脱溶剂离子通过小孔进入质谱的真空系统。离子能够最终靠各种装置分离，包括四极杆、离子阱、磁扇区、飞行时间或回旋共振装置。这些装置的操作原理超出了本讨论的范围。离子通常使用电子或离子倍增器检测。

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